“ 单粒子追踪（single-particle tracking，SPT）是对介质内单个粒子运动的观察。坐标时间序列，可以是二维（x , y）或三维（x , y , z），被称为轨迹。通常使用统计方法分析轨迹，以提取有关粒子潜在动力学的信息。这些动力学可以揭示所观察到的传输类型（例如，热传输或活动传输）、粒子移动的介质以及与其他粒子的相互作用的信息。在随机运动的情况下，可以使用轨迹分析来测量扩散系数。”

显微技术允许使用光漂白后荧光恢复（fluorescence recovery after photobleaching，FRAP）或单粒子或量子点跟踪的单蛋白质迁移率表征蛋白质的全局迁移率分析。例如，全内反射荧光显微镜允许拟南芥质膜蛋白的 SPT，揭示它们的异质分布、低横向扩散和响应盐胁迫的动态特性。然而，基于绿色荧光蛋白的 SPT 研究受到表面蛋白质密度的限制，因为衍射发射荧光会阻止跟踪距离小于 1 μm 的单个蛋白质。而基于时间发射去相关的高密度 SPT 技术，例如使用光激活定位显微镜（single-particle tracking with photoactivated localization microscopy，sptPALM）进行单粒子跟踪，打破了经典光学显微镜的衍射极限并达到纳米级空间分辨率，使得以~20-80 nm 的精度表征质膜蛋白的结构和动态异质性成为可能。在这项研究中，研究者报告了活细胞 sptPALM 技术在植物中的首次使用，提供了单个膜蛋白运动的高密度超分辨率纳米级图像。

《Super-Resolved and Dynamic Imaging of Membrane Proteins in Plant Cells Reveal Contrasting Kinetic Profiles and Multiple Confinement Mechanisms》

01研究结果

1、超高分辨率动态成像

首先，研究者在转基因拟南芥中表达了可用于光活化的mEOS2融合蛋白，并在使用斜向照明后进行了单蛋白追踪。而后从众多稀疏的mEOS2融合蛋白中构建了超分辨率图像，在 5 分钟的实验记录期间，在 ~900平方微米的细胞区域上检测到了 >100,000 个单体荧光点。这组数据分别提供了二维空间密度图和 mEOS2 融合蛋白与两个质膜标记物 AtPIP2;1（质膜内在蛋白）和 LTi6a（低温诱导蛋白）以及液泡膜标记物 AtTIP1;1（液泡膜内在蛋白）的相应轨迹。

图1. sptPALM 成像

AtPIP2;1-mEOS2 显示出异质和稀疏的定位，密度相对较低（1.12 个分子每平方微米）（图 1A，左图）。重建的轨迹反映了高限制行为（图 1A，中图和右图）。LTi6a-mEOS2 的超分辨率图表现出更均匀的分布（图 1B，左图），轨迹图显示具有更高的移动性（图 1B，中图和右图）。AtTIP1;1-mEOS2 的迁移率也被记录下来，证明了 sptPALM 对细胞内膜蛋白的适用性。超分辨率图像表明 AtTIP1;1-mEOS2 的移动性非常快，导致均匀的重新分配（图 1C）。

2、膜蛋白动态轨迹特征

证实细胞间运动行为变异性很弱且可重复后，对于持续160 毫秒（≥8 帧）以上的轨迹，研究者计算了均方位移 （mean square displacement，MSD），以描述分子的扩散特性，并通过线性回归拟合提取瞬时扩散系数 D 。这些迁移率值的对数呈现钟形分布。通过正态分布拟合 D ，提取每个细胞的峰值。在表达 AtPIP2;1-mEOS2 的细胞中观察到的低 D 值表明该蛋白质基本上是固定的。然而，在表达这种融合蛋白的一些细胞中，可以清楚地观察到 D 值的双钟形分布，表明存在少量可移动的蛋白分子。相比之下，LTi6a-mEOS2 和 AtTIP1；1-mEOS2 的扩散行为更强。

图2. 运动轨迹相关指标

这些结果指向了植物膜蛋白的对比动力学特征。运动性最低的 AtPIP2;1-mEOS2 的移动性比其哺乳动物同源物 AQP1 低7到19倍，揭示植物特有的行为；植物细胞质膜中的脂质的扩散系数与 LTi6a 的扩散系数处于同一数量级；最后，发现 AtTIP1;1-mEOS2 的平面迁移率略高于哺乳动物细胞膜蛋白，这代表了膜蛋白记录的最快运动之一，与从桉树细胞中纯化的液泡膜中的脂质处于同一数量级。进一步研究表明肌动蛋白部分与 AtPIP2;1-mEOS2 的运动限制有关，但主要原因是细胞壁通过内部膨胀压力与质膜紧密结合，导致膜蛋白的横向扩散受阻。

02研究总结

• sptPALM 技术可在植物细胞膜蛋白中应用；
• 不同膜蛋白分子的运动特征差别较大，与同源物也有较大差别；
• AtPIP2;1的运动限制主要来源于细胞壁。

在本研究中，研究者主要借助 sptPALM 来破译植物活细胞中液泡膜和质膜蛋白的动态组织。 PALM 与STORM原理相似，STORM同样可用于SPT，且具有更高的分辨率。这项2014年诺贝尔化学奖的发现已在国内实现产业化。 宁波 威斯尼斯人wns888入口科技 有限公司 (INVIEW) 现已发布超高分辨率显微系统 iSTORM ，采用3D随机光学重构技术、高精度细胞实时锁定技术、多通道同时成像技术等，以 纳米级观测精度 、 高稳定性 、 广泛环境适用 、 快速成像 、 简易操作 等优异特性，获得了超过50家科研小组和100多位科研人员的高度认可。

参考文献：

1. Super-Resolved and Dynamic Imaging of Membrane Proteins in Plant Cells Reveal Contrasting Kinetic Profiles and Multiple Confinement Mechanisms

威斯尼斯人wns888入口：

威斯尼斯人wns888入口（INVIEW）是专业从事超高分辨率显微技术和产品研发的科技企业，依托复旦大学的自动控制、新一代信息技术及香港科技大学的生物、光学、图像处理等的技术，拥有光学、生物、自控、机械、信息技术等多领域交叉学科技术团队，将2014年诺贝尔化学奖技术产业化，推出了超高分辨率显微产品，帮助人们以前所未有的视角观察微观世界，突破极限，见所未见。