光学科普

商业荧光显微镜的光源通常选用卤素灯或具有宽带光的氙弧灯。其中宽带光一般用于常规目视观察和荧光激发。考虑到光激发的效率，在激发过程中，一般仅使用部分在特定光谱中可被染料（荧光模块）吸收的发射光，大部分来自光源的光会被不同类型的滤光片阻挡。

不过，由于制造缺陷，实际操作中，这些滤光片可能并不能理想地阻挡所有不需要的光，这样就会造成漏光，漏光会产生噪点并降低图像质量，这也是很多显微镜图像质量不高的原因。

图1、显微镜照明传统光源光谱

此外，因为大多数光能位于吸收光谱区域之外，滤光片还会浪费灯的大部分能量，这意味着在荧光模式下操作显微镜时，我们需要更强大的光源，否则视图中的图像场将变得更暗和模糊。如果发射的光谱可以适合能量吸收染料范围，我们可以有更明亮的视野和更强的信号。所以，一个具有出色发光效率的光源对显微镜非常重要。

在过去的十年中，发光二极管 (LED) 技术发展迅速，光效突破了100Lm/W大关。高光效使 LED 能够在许多应用中取代传统灯。此外，LED 还具有出色的色彩表现、更长的使用寿命等其他优点。经研究实验显示，使用单色 LED 是激发荧光分子的一个很好的解决方案，我们可以选择对应光谱的LED光源作用于各种工作荧光分子。

图2、LED光谱

研究人员 Herman 提出了一种使用 LED 作为光源的频域荧光显微镜。Hohman 将这种新的 LED 技术整合到 Colibri 照明系统中。Bormuth 在荧光显微镜中应用了不同颜色的 LED，可有效抑制 2视频增强DIC的外围光。Hanscheid采用低成本和长寿命 LED 取代荧光显微镜中更昂贵的汞灯以检测结核病 。Albeanu 介绍了使用简单的光管来耦合从 LED 光源发射到荧光显微镜的光。马丁等人和格哈特等人分别在 2009 年和 2011 年使用 LED 光源检测单个分子。

图3、LED 结合 科勒照明光路示意图

此外，大功率应用中的 LED 采用阵列设计形式来增强图像的照明。然而，无论是单个 LED 还是 LED 阵列设计都面临一个关键问题，即来自 LED 的光具有大发散角和宽发光表面积。因此，具有出色光能聚集能力的 LED 照明系统是荧光显微镜所必需的，可以为样品提供更亮的照明和较低的电功耗。在传统光源时代，科勒照明方式具有较好的优势，因此可以考虑LED采用科勒照明。

图4、利用TIR透镜对样本的照明示意图

考虑到LED区别传统光源的特点，工程师们还针对LED研发了专门的全反射（TIR）透镜，上图是利用TIR透镜做的针对样本的照明。总之，随着LED技术的发展，它在显微镜领域的应用价值将越来越大。