传统荧光显微镜的分辨率限制阻碍了病毒蛋白的可视化，因为任何单个荧光信号的尺寸通常大于大多数病毒粒子。超分辨率显微镜有可能在接近电子显微镜的分辨率下揭示蛋白质的分布，而不依赖于EM中所需的生物标本的现有特征的形态特征。
人类免疫缺陷病毒1型 (HIV-1) 近似球形，平均直径为125 ± 14 nm 。它的主要结构成分是含有包膜糖蛋白的脂质双层，位于病毒脂质膜下方的基质壳和具有锥形几何形状的衣壳核心。HIV-1蛋白的荧光标记为它们在感染细胞中的亚细胞定位提供了有价值的见解。然而，由于病毒颗粒小于常规荧光显微镜的分辨率极限，因此难以检测细胞进入和复制的分子机制。 电子显微镜技术提供了结构对HIV-1的见解,但在技术上仍然要求很高，并且容易引入人工制品。该技术在感染过程中具有可视化病毒蛋白分子组织的巨大潜力，尤其是在用荧光蛋白标记会损害病毒感染性的情况下。以前的研究已经使用超分辨率技术来可视化人工转染到细胞系中的病毒蛋白簇。在这项研究中，作者使用dSTORM提供了真正感染淋巴样细胞之前和之后感染性HIV-1颗粒中基质和衣壳蛋白的分子分布之一。
作者使用dSTORM可视化无细胞HIV-1病毒体和感染的淋巴样细胞中的基质和衣壳蛋白。首先产生了包含绿色荧光蛋白-病毒蛋白R融合蛋白 (hivgfp-vpr) 的HIV-1颗粒，这使作者能够用常规荧光显微镜观察颗粒。然后将相同的病毒体制剂均匀地涂在玻璃盖玻片上或用于感染淋巴细胞。重要的是，在允许病毒进入靶细胞20分钟后，通过链蛋白酶处理从靶细胞表面去除非内化的病毒颗粒。这通过将靶细胞与包膜缺陷型HIV-1孵育得到证实，所述包膜缺陷型细胞不能进入靶细胞，因此被链霉蛋白酶切割，因此在这些样品中不能检测到病毒蛋白 (图1)。
图1 链蛋白酶处理从细胞表面去除非内化的病毒颗粒
MT-2细胞在17 °C下用 (a，c) HIVGFP-Vpror (b，d) HIVΔenvGFP-Vpr感染2小时，以使病毒体与细胞结合。之后，将细胞洗涤以除去未结合的病毒颗粒，并在37 °C下孵育20分钟，以使病毒进入细胞。然后将样品分开，将一半的细胞与PBS (a-b) 孵育，而另一半用链蛋白酶 (c-d) 处理以去除非内在化的病毒颗粒。随后，通过宽视场显微镜，然后进行反卷积，对所有样品进行固定，反染色，安装和可视化。GFP以绿色显示，核以蓝色显示。所提供的图像是从以0.3 μ m步长拍摄的28个图像的z堆叠的体积压缩得出的。
因此，与淋巴细胞相关的所有基质和衣壳蛋白簇均被内化。通过细胞因子离心将感染的细胞固定并铺在玻璃盖玻片上。两个样本都是用识别基质或caspid蛋白的抗体免疫染色。作者首先将传统图像与超分辨率图像进行了比较。在TIRF图像中，感染的t淋巴细胞中的HIV-1蛋白表现为明亮的点状结构 (图2a)。在dSTORM中，荧光团的随机激活可以分析单个蛋白质的点扩散功能 (PSF)。
dSTORM揭示了同一蛋白的分布比TIRF图像中更大的异质性 (图2b)。通过dSTORM中蛋白质簇的两个图像的叠加来说明使用dSTORM实现的分辨率的提高。
图2 进入淋巴细胞之前和之后感染HIV-1的单个分子的超分辨率成像
(a-c) 常规全内反射荧光 (TIRF) 图像 (a) 、相应的dSTORM图像 (b) 和HIV-1基质蛋白在同步进入淋巴细胞系MT-2 20分钟后的TIRF (白色) 和dSTORM (红色) 图像 (c) 的叠加。(d) dSTORM定位的分子坐标的定位精度值的直方图，对应于a-c中所示的数据集。定位精度对应于拟合到单个分子的点扩展函数的高斯分布的一个西格玛，并且还受光子和噪声水平的影响。虚线表示平均值。(e-h) 基于Ripley K函数对无细胞病毒体中的基质蛋白进行聚类分析，将分子坐标 (e) 的点分布转换为聚类图，该聚类图具有高度到较少的聚类区域，颜色为红色到蓝色 (f)。从阈值图像 (g) 中提取聚类统计信息，例如数量，大小和相关分子。通过将gfp-vpr (绿色) 的TIRF图像与二元簇图叠加，定量了细胞进入后病毒蛋白与逆转录复合物的关联 (h)。比例尺，a-b中板为5μm; c中板为1μm，e-h中板为2μm。(i) 定量分析无细胞病毒粒子中衣壳蛋白分子簇的直径，并在感染入MT-2细胞后20分钟。误差条表示来自两个实验的代表的每个样本26-173个簇的平均值的标准偏差。
这种单分子成像方法使作者能够在感染过程中跟踪基质壳和衣壳核心的重组，这可能反映了促进HIV-1逆转录过程的结构重排，例如病毒体的未包被。
作者能够通过dSTORM量化HIV-1基质壳和衣壳核心的大小，这些结果与EM所见的已知HIV组织一致。此外，该方法提供了新的信息，表明当细胞进入时，与无细胞HIV-1病毒体相比，病毒体基质壳和衣壳核心的大小显著增加，这表明HIV颗粒在进入靶细胞后立即经历了显著的重排。
总之，这项研究验证了使用dSTORM评估传染性病毒生命周期中病毒蛋白的分子分布，并为在早期阶段研究病毒蛋白的分布和重新分布开辟了新的可能性病毒感染。
